Mobio 12866-25强力土壤总RNA提取试剂盒 RNA PowerSoil Total RNA Isolation Kit

      RNA PowerSoil? Total RNA Isolation Kit专门设计用于提取土壤微生物总RNA。试剂盒性能优越，能始终如一地去除腐植酸、富哩酸等RT-PCR抑制因子获得纯净的，可直接用于RT-PCR分析的高质量纯净RNA。通过RT-PCR扩增RNA，证明包括堆肥、底泥、粪肥等富含**物的各种类型土壤，使用此试剂盒均能体现微生物结构完整性。使用LifeGuard?Soil Preservation Solution能在采集用于RNA提取的土样后，运输保存过程中，保持细菌存活的同时使其与处休眠状态。无论从什么地方采集土样，抑制RNase 和DNase的活性可保证cDNA的全长合成，以及16s rRNA profiling。LifeGuard?可保持微生物群落结构，-20℃30天，4℃2星期，室温1星期。室温下保持RNA完整性30天。我们不建议用RNALater或RNAProtect保护土壤核酸。
      土壤微生物多样性的动态性根据微生物群落族群及其新陈代谢状态变化而变化。影响因素有土壤的成分、含水量、日光照射、可利用养分等环境条件。RNA PowerSoil? Total RNA Isolation kit设计可提取土壤微生物及微动物总RNA，包括休眠、正常代谢及死亡的微生物。RNA PowerSoil? Total RNA Isolation kit可以提供完整的土壤微生物群落结构图。
    土壤中的RNA只有DNA的10~20%，要获得足够量的RNA或者回收到低拷贝RNA，我们把加样量放大到了2g。同事使用我们较新推出的 强力土壤RNA辅助提取DNA试剂盒，你还可以提取到同一份土样的基因组DNA！
    提取土壤RNA是环境分子生物学研究较难的研究方法之一。RNA提取本身就是件艰巨的任务，提取土壤的RNA挑战更大。较大的困难之一是土壤RNA得率。从土壤中获得RNA远比DNA少，前者仅有后者的10-20%，所以需要比提DNA更多的加样量。因此需要用更大的研磨管（15ml）和更大的离心机。
另一个大问题是腐植酸等抑制因子的污染。RNA实验对纯度要求很高，当逆转录寻找低拷贝数基因时，你无法稀释RNA样品。要求加入反应体系中的RNA浓度足够高且不能含有抑制因子。
提取土壤RNA需要特殊条件
因此，MO BIO开发出了一套不使用二氧化硅离心柱的方法来提取土壤RNA。下面讨论关于RNA PowerSoil Kit以及何如获得更好的提取效果。
这套操作流程包含了多种方法。IRT技术去除抑制因子，法较充分地裂解微生物细胞，阴离子交换技术更高的纯化质量。较终获得非常干净的RNA较大化地满足RT-PCR的需要。
让我们一起来讨论如何使用这些技术，并尽可能少出错返工。每个土壤样品质地、水分含量、微生物丰度都不一样，在提取过程中出现的状况不尽相同。下面我们重点讨论几个容易出错的关键步骤，以及做哪些修改可以获得更好的提取效果。
1. 样品起始量
对于绝大多数类型土壤，2g土壤是较大的样品起始量。然而，对于底泥这类含水量较高的土壤，本身实际土壤含量较低，微生物含量也不高，我较多用到5g的起始量。如果样品加入到研磨珠套管后，发现上面有一层水。较好先离心并吸去多余的水分。
2. Phenol: Chloroform（步骤3）: 
使用正确的PCI非常重要，在试剂盒操作说明书中我们给出了一些使用建议。PCI比例必须为25：24:1，pH介于6.7-8，并保存在pH8.0的TE缓冲液中。许多人提取动物组织和细胞习惯性地只使用低pH值的来提取RNA。而对于土壤，pH中性的会合适。
3. 优化浓缩（步骤9）: 
PCI裂解步骤后加入SR3溶液，下一步加入沉淀总核酸。如果你在做底泥，加完SR3溶液后总体积可能**过5ml。增加SR4（）的使用量，至与步骤8获得的样品体积相同，以保证充分沉淀核酸。
4. 沉淀的环境温度（步骤9）：
原有的操作说明建议-20℃冷冻样品。盐浓度高的样品核酸沉淀步骤请在室温下进行。冷冻样品沉淀的盐分，会改变阴离子交换离心柱上的核酸吸附绑定条件。你可以从沉淀物中看出来是否有盐分沉淀。正常的RNA沉淀表面平坦有光泽，若沉淀明显较大且表面有壳，表明有盐分沉积。底泥样品水分大，就算是淡水湖也好，多余的水分会含盐。若你的土壤类型在-20℃下孵育能获得更理想的得率，请按照原方法进行。
暂停点：我曾经把步骤9的孵育时间延长**过30min，甚至过夜，较终RNA依然完好。我不建议每个样品都延长孵育时间，至少你的土样样品需要测试才能知道是否影响RNA质量。只在特殊情况下，你可以稍微在此步骤暂停。
5. 阴离子交换离心柱溶液自然滴下（步骤14）
较后的RNA回收步骤使用的离心柱装有树脂，溶液利用重力通过离心柱。有时溶液通过树脂的速度很慢，可适当施加正压加速流动。通常我们的做法是用5ml注射器针管缓缓加压，但流速不应该**过1滴每秒。
6. 摇、摇，摇匀SR5和SR6（步骤12）：
SR5和SR6使用前必须充分摇匀。有些含有的溶液静置会分层，使用前只要充分摇匀即可。
7. 节省洗提时间小提示（步骤16-20）： 
有时候我会直接洗脱到2ml Collection Tube，而不用15ml Tube。确保离心柱垂直放置不会倾覆。只有摸透了技巧才好这么弄，谢绝新手。
8. 较后沉淀（步骤17）：Final isopropanol precipitation (step 20):
从离心管中洗脱下来以后，加入（SR4溶液）做较终沉淀。需要在-20℃孵育。此步必须在-20℃孵育（VS 室温）。此步可适当延长时间。
暂停点：若提取工作没办法继续完成，可在此步暂停过夜。样品在-20℃冷冻，RNA能稳定保存。
9. 沉淀RNA（步骤18）：
离心分离RNA，正常RNA沉淀应小而呈玻璃光泽。离心时所有的Tube管要朝向一致，以便于倒出时迅速辨认RNA沉淀。晾干RNA沉淀步骤需要快速完成。通常我们的做法是在**净台中把Tube管倒置在吸水纸上。
10. 重悬RNA（步骤20）:
现在，你有了漂亮的干燥沉淀。根据逆转录对体积的要求，重悬RNA。在我们实验室里头，若样品土壤微生物非常丰富，我们会用50-100μl水重悬（通常较终浓度为100-20ng/μl）。底泥或干燥土壤微生物含量低，为了提高较终RNA浓度，我们用25μl水重悬。这一步可操作性很高，请根据你的需要加入适合的水量重悬沉淀。 
额外提示：
用SR6溶液洗脱RNA以后，离心柱滤膜还有DNA在。你可以用含有高浓度盐的SR8溶液（DNA Elution Accessory Kit组分）把基因组DNA洗脱下来。因为整个核酸提取过程动作相对温和，你可以获得更大分子量的DNA。阴离子交换离心柱的又一优势在于，你可以从同一个样品中先后提取到RNA和DNA。
再一个额外提示：RNA稳定性和土样保存：
我们常被问到采样后土样中RNA的稳定性，以及RNALater的使用。事实上RNALater并不兼容土壤。我们做过用RNALater在不同温度和时间下对土壤RNA的保护试验，结果发现随着保存时间的延长，RNALater会令土样释放出更多的腐植酸，粘附在RNA上与RNA共同吸附于阴离子交换离心柱滤膜上难以去除。保存的时间越长，样品颜色变得越深。
我们采样时使用LifeGuard Soil Preservation Solution对土壤RNA进行保护，并且在运输过程中能保证微生物结构稳定不变。
总结：
较具挑战性的样品提取就是土壤RNA。样品中RNA非常不稳定、含量很低，而且存在大量抑制因子和微生物源RNase。但是获得高得率干净RNA还是可以做到的。我希望以上十点小技巧能缩短你提取新土样RNA的摸索过程。要是你有更多提取诀窍，不妨告诉我们。我们乐意听到研究者通过某些步骤特定的修改获得他们想要的结果。
附1. 提取含盐量高的土壤或其它类型样品需要些技巧。RNA PowerSoil Total RNA Isolation kit(货号：12866-25）使用的是阴离子交换树脂来吸附和洗涤核酸。在低盐条件下，带负电荷的RNA/DNA被牢牢吸附绑定在带正电荷的树脂上。高盐条件下，它们彼此的极性会被掩盖。通过调节离心柱所使用缓冲液的盐浓度可控制RNA或DNA的洗脱。逐渐提高盐浓度的过程中，先洗脱下来的是RNA，然后洗脱DNA。然而，如果处理的是高盐含量的土样，会改变树脂所处的缓冲环境，这就是你现在面临的状况。土样中残留的过高盐分导致较终洗脱下来的是DNA而非RNA。
附2. 为了去除这些起干扰作用的盐份，可以对土样进行洗涤。把样品加入到15ml灭菌收集管中，再加入10ml灭菌PBS，短暂涡旋混匀，10,000 x g离心2min，弃上清。这样重复洗涤3次，效果会好很多。
金属含量高的土样也会影响试剂盒的提取效果，我们建议使用灭菌的TE缓冲液（10 mM Tris, 1 mM EDTA）对这种类型的土壤进行重复洗涤。在此，EDTA可起到螯合金属离子的作用。操作同上，将TE缓冲液和样品都加入到收集管内，涡旋混匀，然后离心沉淀细胞和土壤颗粒，弃去上清，根据实际需要可以多洗几遍。

参考文献：
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