解答植物DNA和RNA 提取过程的根本问题

如果你已经能提取到高质量的大象DNA，那么你也能提小鼠、大鼠，甚至猫鼬的DNA。但是，如果你提取到了拟南芥的DNA，那并不代表你能提取所有类型植物样品的DNA。现代植物已经进化出各种化学武器来应对较端环境、病原侵害，以及掠食者的捕食。植物们逃进了巨大的**化合物的避风港，有些化合物能帮助植物体抵抗真菌、细菌，有些带来糟糕的口感抵制捕食者。另一些高分子物质构成复杂系统来储存水和养分帮助渡过恶劣气候。

这些物质对植物好处多多，而对于DNA提取却是件麻烦事。。。如类会不可逆地吸附DNA，抑制后续酶应用。多聚糖在提取过程中与DNA交联，混合物呈烂泥状。植物的不同科、属，甚至种间都可能含有截然不同种类、含量的复杂**化合物，使得对于某种植物非常奏效的提取方法可能无法普及到另一种植物。这对于植物分子生物学家来说简直是场噩梦。

怪不得有那么多植物学家来电咨询时都怀疑是否真有现成的试剂盒给他们用。虽然我们的PowerPlant? Pro DNA和 PowerPlant? RNA提取试剂盒并不是所有类型植物的较终解决方案，但确实是给植物学家们指向正确方向的福音。我们的PowerPlant?试剂盒能帮助你从各种样品中获得高质量的DNA和RNA，再也不用烦恼于传统费时费力的、CTAB、和的核酸提取方法了。

提取DNA

提取DNA的第一步就是细胞破壁，植物DNA的提取也不例外。不像动物组织，植物细胞壁非常坚硬且能抵御渗透压。为获得DNA，我们需要使用点暴力。传统方法使用、研钵和研杵碾碎冷冻的组织。此方法能凑效，缺点是费时，容易交叉污染。在MO BIO我们使用一种物理裂解方法叫珠磨研磨。把少量样品放入含有裂解缓冲液和研磨珠的厚壁研磨管，放到涡旋仪的适配器或者强力高速珠磨研磨设备上进行涡旋振荡。该方法漂亮之处在于每个样品在自己的无菌研磨管中均质化。我们试验发现加入少量的不锈钢研磨珠和直径2-3mm的陶瓷研磨珠破碎植物组织的效果较好。

多聚糖多

一旦植物细胞裂解开，DNA就混杂于前面提到的各种植物分子，需要立马处理。黄酮类、花青素、木脂素类和单宁酸等多能大大减低人类患癌的风险。但对DNA提取却不友好。近年来对于植物多的正面认识使得越来越多的科学家注意力集中在多含量很高的植物身上。在过去的6个月里，我们收到了大量关于提取大豆、巧克力、咖啡、草莓、橘皮、葵花子和玉米等植物样品的咨询电话，而正是这些植物的多含量都很高。

当破碎植物材料获取DNA时，多类物质就暴露于氧气中开始与多氧化酶发生反应。[正是这种酶使切开的苹果或土豆变棕色的。]多的氧化产品会与核酸产生共价交联，几乎不能去除掉。只有在一开始就抑制反应。常用的方法有去垢剂（CTAB 和SDS），抗氧化剂（βME、抗坏血酸和DTT）或者某些高分子化合物（聚烷酮（PVP）和交联聚烷酮（PVPP）。去垢剂可以增加脂质和酶的可溶性，使其轻易被去除。抗氧化剂变性或抑制PPO酶的活性，减慢多的氧化过程。PVPP和PVP能交联多物质，防止他们与DNA反应。

在我们的PowerPlant Pro DNA 和 RNA提取试剂盒都是用了特殊的溶液Phenolic Separation Solution (PSS)，可以在均质样品前就加入到研磨管中。它能非常高效地抑制多活性。但我们也发现对某些样品能显着提高核酸得率，而对另一些样品却似乎毫无效果。可能跟植物种类有关系。所以建议先做个对比测试，以决定你的样品是否需要添加PSS。

多聚糖，植物的食物储存形式，是提取植物DNA的另一顽疾。植物多聚糖种类繁多存量可以非常巨大。可能所有的DNA都被它们吸附住，你能在DNA悬浮液中看到明显的粘稠状。人们做下游酶反应实验的时候发现多聚糖还能分成酸性和中性。酸性多聚糖会抑制PCR和酶切，而中性多聚糖则不会。常见的酸性多聚糖有果胶、木聚糖、和角叉菜胶，中性多聚糖有右旋糖酐、刺槐豆胶、淀粉和菊粉。

DNA制备过程的高盐条件可以轻易去除酸性多聚糖。DNA较易与阳离子去垢剂如CTAB结合，而CTAB：多聚糖复合物则**沉淀并去除掉。此方法的小缺点是费时、费钱。 我们的PowerPlant Pro DNA 和 RNA提取试剂盒摒弃传统的CTAB，采用我们**的抑制因子去除技术（Inhibitor Removal Technology?）。联合裂解缓冲液中的化学试剂盒随后的珠磨研磨能有效地去除多聚糖。有些多聚糖含量很高的样品建议减少加样量，以免**过化学试剂的处理能力。多聚糖较易与酒精发生反应生成胶状液滴妨碍后续核酸的离心柱吸附等。

选取合适部位取样

最后需要提醒一点的是，不是所有植物的多聚糖多含量都是一致的，同一种植物在其不同生长周期也会发生变化。有些植物的叶片含大量多，根部却很少。另一些植物茎部储存大量糖分，叶片却很少。所以如果某个部位提取的DNA得率不太理想，尝试取另一个部位试试。在植物世界里，通常幼嫩植物含有的"防御性物质"较少，适合提取取样。当然，凡是没有**。如果你要提取特定部位的RNA或者寄生真菌DNA，就没那么舒坦了。你得依靠强大的化学溶液来获得较好的核酸提取效果。

参考文献：

·  BioTechniques 13: 52-56; (1992). A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Fang G, Hammar S, and Grumet R.

·  Plant Mol Biol Rep 17:1-8.; (1999) An improved and rapid protocol for the isolation of polysaccharide- and polyphenol-free sugarcane DNA. Aljanabi SM, Forget L, and Dookun A

·  J Plant Mol Biol Biotechnol 2011 2: (2) 1-7; Biochemical Role of Ascorbic acid during the Extraction of Nucleid Acids in Polyphenol Rich Medicinal Plant Tissues; Tushar BORSE1,2*, Prashant JOSHI 2 and Sushama CHAPHALKAR1,2

·  Biotechniques. 1991 Feb;10(2):162, 164, 166. A simple technique for removing plant polysaccharide contaminants from DNA. Do N, Adams RP.

·  Phenol-Explorer: an online comprehensive database on polyphenol contents in foods. Database, doi: 10.1093/database/bap024.Neveu V, Perez-Jiménez J, Vos F, Crespy V, du Chaffaut L, Mennen L, Knox C, E isner R, Cruz J, Wishart D , Scalbert A. (2010)

·  HortScience,Dec 1992; 27: 1316 – 1318. A Rapid Procedure for the Isolation of RNA from High-phenolic-containing Tissues of Pecan; Amnon Levi, Glenn A. Galau, and Hazel Y. Wetzstein;

·  PROTOCOLS Isolation of milligram quantities of nuclear DNA from tomato (Lycopersicon esculentum), A plant containing high levels of polyphenolic compounds. Daniel G. Peterson, Kevin S. Boehm and Stephen M. Stack

·  Plant Mol. Biol. Rep. 23: 297a-297i. (2005) Angeles JGC, Laurena AC, Maetecson-Mendoza E. Extraction of genomic DNA from the lipid-, polysaccharide-, and polyphenol-rich coconut (Cocos nucifera L.).

·  Kim CS, Lee CH, Shin JS, Chung YS, and Hyung NI (1997) A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Res 25: 1085-1086